CRISPR技術(shù)新成員：教基因剪刀檢測RNA

細菌已經(jīng)發(fā)展出特殊的防御機制來保護自己免受病毒的侵害，而病毒絕不僅僅感染人類。作為這些所謂的CRISPR- cas系統(tǒng)的一部分，作為“向?qū)?/span>RNA”的CRISPR核糖核酸(crRNA)可以識別外來基因組的區(qū)域，例如病毒DNA。crispr相關(guān)(Cas)核酸酶在crRNA的指導(dǎo)下，像剪刀一樣將其切割成無害的。人類已經(jīng)利用了這一策略:“CRISPR，通常被稱為‘基因剪刀’，是許多分子技術(shù)的基礎(chǔ)，”Helmholtz RNA感染研究所(HIRI) RNA合成生物學(xué)系主任Chase Beisel說。

Beisel實驗室與JMU于2021年合作開發(fā)的診斷平臺LEOPARD也利用了CRISPR技術(shù)。LEOPARD有潛力在一次測試中檢測各種疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物。這種方法是基于對RNA因子進行重編程，即所謂的tracrRNAs。這些rna自然參與幫助產(chǎn)生Cas9和不同Cas12核酸酶使用的引導(dǎo)rna。LEOPARD專注于Cas9。然而，CRISPR-Cas系統(tǒng)還包括另一組不同的核酸酶，稱為Cas12，”Beisel解釋說。雖然Cas9和Cas12都能切割DNA靶標(biāo)，但Cas12可以通過切割“附屬”DNA來增加輸出信號。這可以使檢測技術(shù)更敏感，從而更有效。

Chase Beisel領(lǐng)導(dǎo)的團隊現(xiàn)在已經(jīng)將LEOPARD的獨特功能擴展到了Cas12。研究人員將這種方法命名為PUMA(可編程tracrnas解鎖原間隔區(qū)鄰近基序的Cas12核酸酶獨立檢測核糖核酸)。他們發(fā)現(xiàn)的細節(jié)是《自然通訊》雜志上一篇論文的主題。

盡管Cas12核酸酶在分子診斷中得到了廣泛的應(yīng)用，但仍然存在兩個主要的限制:基于Cas12的技術(shù)**于DNA靶標(biāo)，并且需要一個稱為PAM的特定識別序列來識別目標(biāo)分子。

PUMA優(yōu)雅地應(yīng)對了這些挑戰(zhàn)。和LEOPARD一樣，這種新方法也依賴于tracrrna。“使用PUMA，我們可以重新編程tracrrna。這使我們能夠決定哪個RNA生物標(biāo)記物成為向?qū)?/span>RNA。

該研究的**作者Chunlei Jiao解釋說:“這種引導(dǎo)RNA反過來將Cas12引導(dǎo)到我們提供的DNA分子上，并激活基因剪刀。”

Beisel補充說:“DNA切割告訴我們樣品中存在哪種生物標(biāo)志物，例如針對不同病原體的生物標(biāo)志物。”

因此，這種新方法能夠使用通常只能識別DNA的CRISPR核酸酶檢測RNA生物標(biāo)志物。“這對于只能在RNA水平上發(fā)現(xiàn)的分子生物標(biāo)志物尤其重要。例如，這包括RNA病毒，”然而，PUMA不需要特定的識別序列:PAM包含在提供的DNA靶分子中。由于研究人員提供了目標(biāo)分子，他們也可以引入截短的DNA。因此，他們能夠顯著提高該方法的速度。

“PUMA有潛力成為一種靈活而精確的RNA檢測工具，”Beisel總結(jié)道。最后，該團隊通過鑒定與急性敗血癥相關(guān)的五種細菌病原體，證明了該方法的潛力。他們的檢測依賴于一個單一的通用的、重編程的tracrRNA，它提供了一種區(qū)分不同類型細菌的簡化方法。這在醫(yī)學(xué)上開辟了廣泛的潛在應(yīng)用:“這項新技術(shù)代表了一種新的CRISPR診斷形式，可以在護理點進行可靠的分子檢測——無論是病毒或細菌病原體的鑒定，還是癌癥生物標(biāo)志物的檢測，”Chunlei Jiao說。

研究小組已經(jīng)在計劃下一步:“我們的目標(biāo)是實現(xiàn)與LEOPARD類似的多路讀出，并擴大該技術(shù)的應(yīng)用范圍，”Beisel說，他還預(yù)計該技術(shù)將在研究界得到廣泛應(yīng)用:“我們希望我們的研究將促進對tracrRNA重編程的進一步探索。”

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