馬血清培養(yǎng)原代神經(jīng)元細(xì)胞的方法

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

材料收集

新生（通常 1 - 3 天）大鼠或小鼠，幼崽神經(jīng)系統(tǒng)處于快速發(fā)育階段，神經(jīng)元活力高，更易分離培養(yǎng)成功。

馬血清：需采購(gòu)優(yōu)質(zhì)、無(wú)菌、經(jīng)過(guò)檢測(cè)無(wú)支原體等污染的馬血清，儲(chǔ)存在 -20℃，使用前在 4℃緩慢解凍，避免反復(fù)凍融破壞血清中的活性成分。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：如 DMEM（高糖型，為神經(jīng)元生長(zhǎng)提供充足能量）、Neurobasal 培養(yǎng)基等，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并按需添加谷氨酰胺等營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑維持細(xì)胞代謝。

解剖器械：精細(xì)鑷子、剪刀（需滅菌處理），用于分離腦組織。

培養(yǎng)器皿：多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿或蓋玻片，可促進(jìn)神經(jīng)元貼壁生長(zhǎng)，提前將其放入培養(yǎng)箱預(yù)熱。

試劑配制

含馬血清的培養(yǎng)基：將馬血清按一定比例（一般 10% - 20%，可依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化比例）與基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合，加入適量青霉素 - 鏈霉素雙抗（防止細(xì)菌污染，終濃度通常 100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素），用 0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌。

二、原代神經(jīng)元細(xì)胞分離

動(dòng)物麻醉與消毒

用低溫麻醉法或適宜的吸入性麻醉劑（如異氟烷）將新生動(dòng)物麻醉，確保深度麻醉后，將其浸泡于 75% 酒精中消毒 3 - 5 分鐘，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)。

腦組織獲取

在無(wú)菌條件下，用鑷子、剪刀快速斷頭，取出完整大腦，置于預(yù)冷的 Hank's 平衡鹽溶液（HBSS）中，盡量減少組織暴露在空氣中的時(shí)間，防止干燥損傷。

細(xì)胞解離

去除腦膜、血管等非神經(jīng)組織后，將腦組織剪成細(xì)小碎塊，轉(zhuǎn)移至含適量胰蛋白酶（一般 0.25%）的離心管中，37℃水浴消化 10 - 15 分鐘，期間輕輕搖晃，使細(xì)胞充分解離。消化結(jié)束后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。

三、細(xì)胞接種與培養(yǎng)

細(xì)胞懸液制備

將消化后的組織懸液通過(guò)輕柔吹打使其進(jìn)一步分散，制成單細(xì)胞懸液，用 200 目濾網(wǎng)過(guò)濾去除未消化的組織塊，收集濾液。

接種

按照一定密度（如 1×10? - 5×10? 個(gè) /mL）將細(xì)胞懸液接種到提前預(yù)熱、包被好的培養(yǎng)器皿中，輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞均勻分布，放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件維持

前 24 小時(shí)盡量避免移動(dòng)培養(yǎng)器皿，減少對(duì)剛貼壁細(xì)胞的擾動(dòng)。定期觀察細(xì)胞狀態(tài)，每 2 - 3 天半量更換含馬血清的新鮮培養(yǎng)基，維持營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)與環(huán)境穩(wěn)定，注意換液時(shí)操作輕柔，防止細(xì)胞脫落。

四、細(xì)胞鑒定與監(jiān)測(cè)

免疫熒光染色

培養(yǎng)一定時(shí)間（如 5 - 7 天）后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)并初步分化，可進(jìn)行免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元特異性標(biāo)志物（如 MAP2、NeuN 等）。用 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1% Triton X - 100 通透處理，依次加入一抗、二抗孵育，最后用 DAPI 染核，在熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)量，評(píng)估培養(yǎng)效果。

細(xì)胞活性監(jiān)測(cè)

定期采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法或 CCK - 8 等細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，了解細(xì)胞增殖、存活情況，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大量死亡或生長(zhǎng)異常，及時(shí)排查培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境等因素并調(diào)整。

通過(guò)以上步驟，利用馬血清培養(yǎng)原代神經(jīng)元細(xì)胞，可為神經(jīng)科學(xué)相關(guān)研究，如神經(jīng)發(fā)育機(jī)制、神經(jīng)疾病模型構(gòu)建等提供基礎(chǔ)的細(xì)胞模型支持。但整個(gè)過(guò)程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，精細(xì)調(diào)控各環(huán)節(jié)參數(shù)，確保培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)量可靠。