肌萎縮側(cè)索硬化癥新探索:構(gòu)建新的隱剪接 選擇性糾正TDP-43缺陷引起的ALS相關(guān)隱外顯子剪接錯(cuò)誤

精準(zhǔn)醫(yī)療設(shè)想在正確的時(shí)間將正確的藥物提供給正確的細(xì)胞。這種方法徹底改變了癌癥治療，根據(jù)特定的突變或其他分子特征來(lái)設(shè)計(jì)針對(duì)腫瘤的藥物。鑒于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方法在腫瘤學(xué)領(lǐng)域的成功，將類(lèi)似的策略應(yīng)用于腦部疾病——只對(duì)需要治療的腦細(xì)胞提供治療而不影響健康的腦細(xì)胞——將是革命性的。

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種致命的神經(jīng)退行性疾病，由大腦和脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性喪失引起。這種疾病有許多不同的潛在遺傳和環(huán)境因素，但幾乎所有ALS患者的神經(jīng)系統(tǒng)都有一個(gè)共同的分子特征——小部分神經(jīng)元亞群細(xì)胞核中一種叫做TDP-43（TAR DNA-binding Protein)的RNA結(jié)合蛋白的功能喪失。TDP-43缺失導(dǎo)致一種與隱外顯子剪接出錯(cuò)有關(guān)的RNA加工事件。這一分子事件改變了數(shù)千個(gè)RNA的正常處理過(guò)程，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙。我們都知道正常細(xì)胞中成熟的mRNA中通常不包括內(nèi)含子中的DNA序列，TDP-43結(jié)合在這些隱外顯子附近，并確保它們被剪接出來(lái)。當(dāng)TDP-43從細(xì)胞核中丟失時(shí)，這種抑制就會(huì)丟失，成熟的mRNA中就保留了隱外顯子（ cryptic exons）。那些對(duì)神經(jīng)元功能至關(guān)重要的基因或攜帶疾病風(fēng)險(xiǎn)變異的基因轉(zhuǎn)錄子中若保留多余的隱外顯子，會(huì)引起閱讀框移碼、降低RNA穩(wěn)定性、或產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)同種異構(gòu)體。TDP-43功能喪失 (TDP-LOF)也是多種其他神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志。

但在ALS患者中并不是所有的神經(jīng)元都有TDP-43缺陷，所以挑戰(zhàn)之一是只靶向那些具有TDP-43病理的神經(jīng)元，而不是那些具有正常TDP-43功能的神經(jīng)元，避免進(jìn)一步惡化病情。

來(lái)自英國(guó)倫敦大學(xué)學(xué)院的研究人員在新一期《Science》上描述了一種治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病——肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)的精確醫(yī)學(xué)策略：遞送合成的“隱式”外顯子，僅在顯示ALS特征的細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，這些發(fā)現(xiàn)為ALS的研究開(kāi)辟了新的方向——將隱剪接事件（cryptic splicing events）作為潛在生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，也為神經(jīng)退行性疾病的精準(zhǔn)醫(yī)療策略打下基礎(chǔ)。

如何找出一種方法來(lái)區(qū)分TDP-43功能喪失的細(xì)胞和TDP-43功能正常的細(xì)胞？作者聰明地意識(shí)到，他們可以利用TDP-43功能喪失的關(guān)鍵——隱外顯子作為一種傳感器，來(lái)檢測(cè)TDP-43何時(shí)何地功能失調(diào)，然后只對(duì)這些缺陷細(xì)胞進(jìn)行治療。作者首先設(shè)計(jì)一種僅當(dāng)TDP-43功能失調(diào)時(shí)能在細(xì)胞中開(kāi)啟紅色熒光蛋白表達(dá)的結(jié)構(gòu)——構(gòu)建了一個(gè)包含編碼紅色熒光蛋白序列的嵌合基因，在具有正常TDP-43功能的細(xì)胞中隱外顯子被移除會(huì)阻止熒光蛋白質(zhì)產(chǎn)生；但在沒(méi)有TDP-43的細(xì)胞中隱外顯子保留了下來(lái)，使熒光蛋白得以產(chǎn)生。他們將這種嵌合基因引入經(jīng)過(guò)改造的人類(lèi)細(xì)胞系中，通過(guò)藥物來(lái)關(guān)閉TDP-43時(shí)細(xì)胞發(fā)出紅光。作者將該系統(tǒng)命名為T(mén)DP-REG，因?yàn)樗试S他們利用TDP-43作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)器的功能，可根據(jù)剪接變化，實(shí)現(xiàn)疾病特異性基因治療表達(dá)的空間和時(shí)間調(diào)控。

驗(yàn)證了TDP-REG工具，作者嘗試用它來(lái)糾正與ALS相關(guān)的單個(gè)隱剪接事件。他們用一種經(jīng)過(guò)修飾的Cas9酶代替了熒光蛋白，這種Cas9酶允許進(jìn)行靶向基因組編輯。

他們首先對(duì)編碼UNC-13同源蛋白的UNC13A基因進(jìn)行“搜索和替換”編輯，阻斷了TDP- 43缺陷神經(jīng)元中UNC13A基因的隱外顯子，使之在沒(méi)有TDP- 43的情況下成熟UNC13A mRNA也不包含隱外顯子，維持缺陷神經(jīng)元中UNC13A蛋白的正常水平。這是v1版。

然后，作者對(duì)TDP-REG進(jìn)行了v2版修改：不僅一次修復(fù)一個(gè)TDP-43調(diào)節(jié)的隱外顯子，而且能同時(shí)糾正多個(gè)隱外顯子。他們通過(guò)使用TDP-43和核糖核蛋白PTB結(jié)合1 (RAVER1)蛋白的剪接抑制域之間的融合蛋白實(shí)現(xiàn)了這一目標(biāo)。

肌萎縮側(cè)索硬化癥是一種具有毀滅性的侵襲性和快速發(fā)展的疾病，一旦做出診斷，治療可能為時(shí)已晚，無(wú)法發(fā)揮作用。這種巧妙的治療策略，可以在需要治療的神經(jīng)元而不是不需要治療的神經(jīng)元中糾正ALS的病理。由于TDP-REG內(nèi)置的安全功能，作者認(rèn)為可以在有患病風(fēng)險(xiǎn)的患者(可能是因?yàn)檫z傳易感性因素，TDP-43功能障礙被激活之前)在癥狀前階段接受這些治療。TDP-REG的模塊化設(shè)計(jì)策略也可能支持未來(lái)的修改，以針對(duì)新的疾病相關(guān)病理、細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞狀態(tài)。這項(xiàng)工作使我們離神經(jīng)退行性疾病(如ALS)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療又近了一步。

鑒于TDP-LOF功能缺失是ALS、FTD和其他常見(jiàn)神經(jīng)退行性疾病(包括阿爾茨海默病和LATE)的標(biāo)志，TDP-REG可能在這些疾病的治療中具有廣泛的用途。在單細(xì)胞分辨率下，疾病誘導(dǎo)的基因療法激活可能有助于減輕患者**轉(zhuǎn)基因表達(dá)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。此外，在攜帶ALS因果遺傳變異的高危個(gè)體中，TDP-REG的空間和時(shí)間特異性可以使治療藥物在癥狀前階段進(jìn)行，直到檢測(cè)到TDP-43病理的**階段。此外，TDP-REG可用于藥物開(kāi)發(fā)的臨床前階段，作為細(xì)胞甚至活體動(dòng)物中TDP-43病理的實(shí)時(shí)讀數(shù)。

TDP-REGv1涉及轉(zhuǎn)基因與上游調(diào)控模塊的融合，具有源自現(xiàn)有人類(lèi)基因的修飾隱外顯子序列。這種方法有幾個(gè)好處：作為模塊化設(shè)計(jì)，不同的轉(zhuǎn)基因可以由相同的上游調(diào)控模塊控制。此外，TDP-REGv1是基于經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證的、以疾病特異性方式在患者中檢測(cè)到的內(nèi)源性隱外顯子。

相比之下，TDP-REGv2使用嵌入轉(zhuǎn)基因序列本身的合成剪接傳感器。這解決了TDP-REGv1和以前方法的幾個(gè)局限性:它不需要長(zhǎng)時(shí)間的上游調(diào)控區(qū)域，從而有助于將大型轉(zhuǎn)基因包裝成AAV載體；它阻止上游不需要的肽被表達(dá)并釋放到細(xì)胞中，而且它是高度可調(diào)的，這意味著剪接特性可以針對(duì)所傳遞的特定轉(zhuǎn)基因進(jìn)行優(yōu)化。

拼接規(guī)律是一個(gè)非常復(fù)雜的問(wèn)題，難以用傳統(tǒng)的算法進(jìn)行預(yù)測(cè)。在TDP-REGv2的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，作者創(chuàng)建了一個(gè)名為SpliceNouveau的算法，該算法利用深度學(xué)習(xí)拼接預(yù)測(cè)和合理設(shè)計(jì)原則來(lái)優(yōu)化向量，幫助確保它們以所需的方式拼接。使用SpliceNouveau成功設(shè)計(jì)了當(dāng)TDP-43存在時(shí)優(yōu)先使用的競(jìng)爭(zhēng)性替代剪接位點(diǎn)，成功地生成了隱式盒外顯子和隱式替代剪接位點(diǎn)。SpliceNouveau設(shè)計(jì)的載體的靈活性和高成功率代表了剪接調(diào)節(jié)載體技術(shù)的重大進(jìn)步。

這項(xiàng)研究證明了如何反向利用驅(qū)動(dòng)ALS和FTD進(jìn)展的隱剪接，以實(shí)現(xiàn)靶向異常細(xì)胞的治療性蛋白表達(dá)。這種方法與先前已被批準(zhǔn)用于基因治療的傳統(tǒng)AAV兼容，可以很容易地適用于不同的轉(zhuǎn)基因，包括調(diào)整其**表達(dá)和對(duì)TDP-43缺失的敏感性。這將**限度地減少毒副作用的風(fēng)險(xiǎn)，從而提高在臨床試驗(yàn)期間獲得可衡量改善的機(jī)會(huì)，減少患者的危險(xiǎn)。

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