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『支原體qPCR檢測(cè)』的方法學(xué)驗(yàn)證

2020-12-29 15:39來(lái)源:威正翔禹|締一生物

在生物制品和細(xì)胞治療領(lǐng)域,支原體檢查是保證產(chǎn)品和治療安全的重要一環(huán)。生物源性原材料、采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備的疫苗、抗體,以及細(xì)胞或基因治療產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程的不同階段都要進(jìn)行支原體污染的檢查。

傳統(tǒng)支原體檢查方法是培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法,并為藥典所認(rèn)可和收錄。近年來(lái),『支原體qPCR檢測(cè)』在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越多,但在項(xiàng)目申報(bào)前,先需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,依據(jù)藥典,在檢測(cè)限、特異性和耐用性方面達(dá)到要求后,才能替代傳統(tǒng)的檢查方法。


就筆者所知,在適合工業(yè)的支原體檢測(cè)和方法驗(yàn)證方面,德國(guó)Minerva Biolabs(簡(jiǎn)稱(chēng)MB)公司已有很成熟的產(chǎn)品及商業(yè)化應(yīng)用,它不僅提供有符合國(guó)際藥典的『支原體qPCR檢測(cè)』試劑盒,而且有一系列支原體標(biāo)準(zhǔn)品及輔助產(chǎn)品,用于qPCR方法的全面驗(yàn)證。這些產(chǎn)品性?xún)r(jià)比也較高,全球許多客戶(hù)都在使用。


下面,筆者就『支原體qPCR檢測(cè)』方法驗(yàn)證的一般要求、德國(guó)MB公司提供的『支原體qPCR檢測(cè)』的方法驗(yàn)證產(chǎn)品闡述如下。

一、『支原體qPCR檢測(cè)』方法驗(yàn)證的一般要求


各國(guó)藥典對(duì)支原體核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法(簡(jiǎn)稱(chēng)NAT法)的驗(yàn)證要求略有出入,但均要求對(duì)最低檢出限、特異性和耐用性進(jìn)行驗(yàn)證。在檢測(cè)方法上,均要求先做樣本的支原體DNA抽提,再進(jìn)行支原體檢測(cè)。


如使用商品化試劑盒,則除了需要試劑盒生產(chǎn)商提供完整的方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)外,還需要使用者驗(yàn)證試劑盒對(duì)其樣本的適用性,以及試劑盒表現(xiàn)出預(yù)期的性能(例如檢測(cè)限、耐用性、是否存在與細(xì)菌的交叉反應(yīng))。這些必須由使用者自己來(lái)證明。


在最低檢出限驗(yàn)證中,歐洲藥典(簡(jiǎn)稱(chēng)EP)規(guī)定了污染細(xì)胞的常見(jiàn)9種支原體,要求NAT如替代培養(yǎng)法,對(duì)這9種支原體的檢測(cè)限需均達(dá)到10CFU/ml。其中如果生產(chǎn)中未采用昆蟲(chóng)或植物源材料,可不必檢檸檬螺原體(Spiroplasma citri);如果生產(chǎn)中未使用或暴露于禽源材料,可不必檢關(guān)節(jié)液支原體(M. synoviae)。


日本藥典(簡(jiǎn)稱(chēng)JP)中的驗(yàn)證要求與EP基本一致,但在最低檢出限驗(yàn)證中,JP 17未提及雞敗血支原體,但增加了唾液支原體的驗(yàn)證。


最終待驗(yàn)證的支原體物種的選擇,在依據(jù)藥典基礎(chǔ)上,還需根據(jù)支原體污染風(fēng)險(xiǎn)大小而定。污染風(fēng)險(xiǎn)的影響因素有支原體寄生的宿主細(xì)胞的特異性、原材料的來(lái)源、產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域等。


德國(guó)MB公司提供有10CFUTM支原體高敏標(biāo)準(zhǔn)品,可同時(shí)用于檢測(cè)限和耐用性的驗(yàn)證。

關(guān)于檢測(cè)限和耐用性的檢測(cè)次數(shù),有如下公式可參考:

檢測(cè)次數(shù) = 支原體物種數(shù) × 3 輪獨(dú)立檢測(cè) × 8個(gè)復(fù)孔/每個(gè)物種/每輪


以歐洲藥典規(guī)定的9種支原體為例,實(shí)際所需檢測(cè)次數(shù)為9 × 3 × 8 = 216 次檢測(cè)。


加上陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、無(wú)模板對(duì)照以及特異性驗(yàn)證,預(yù)計(jì)規(guī)格為250次/盒的試劑盒較為適合。


在NAT法的特異性驗(yàn)證方面,歐洲藥典EP2.6.7指出,梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系,應(yīng)優(yōu)先選擇進(jìn)行驗(yàn)證。


至于更具體的驗(yàn)證方案,還需要使用者針對(duì)自己的產(chǎn)品以及流程自行設(shè)計(jì),德國(guó)MB公司也可協(xié)助完善。



二、德國(guó)MB公司提供的『支原體qPCR檢測(cè)』方法的驗(yàn)證產(chǎn)品


下面列出的方法驗(yàn)證所需產(chǎn)品,具體有四個(gè)表,供使用者參考:

表1.『支原體qPCR檢測(cè)』方法驗(yàn)證所需產(chǎn)品


序號(hào)

品名

貨號(hào)

規(guī)格


1

支原體高敏標(biāo)準(zhǔn)品套裝

英文名:10CFU? Mycoplasma Sensitivity Standards-Mycoplasma set

(注:根據(jù)EP2.6.7,如果生產(chǎn)中未采用昆蟲(chóng)或植物源材料,可不必檢檸檬螺原體Spiroplasma citri;如果生產(chǎn)中未使用或暴露于禽源材料,可不必檢關(guān)節(jié)液支原體M. synoviae)






102-0002

歐洲藥典2.6.7列舉的9種支原體每種有2管,10cfu/管,共18管;陰性對(duì)照2管


2

10CFUTM唾液支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品

英文名:10CFU? Mycoplasma Sensitivity Standards-Mycoplasma salivarium(可選)

(說(shuō)明:日本藥典要求對(duì)10CFU唾液支原體的檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證)





102-1103

10cfu×3管+陰性對(duì)照2管/盒


3

特異性驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)品(詳見(jiàn)表2)




4

支原體DNA提取試劑盒

(適用于人工提?。?/span>

英文名:

Venor?GeM Sample Preparation Kit

56-1010

10次/盒



56-1050

50次/盒



56-1200

200次/盒


5

支原體熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒

英文名:Verno? Gem qEP

11-9025

25次/盒



11-9100

100次/盒



11-9250

250次/盒


6

其他輔助產(chǎn)品(詳見(jiàn)表3)




7

qPCR方法驗(yàn)證所需設(shè)備、儀器(詳見(jiàn)表4)




表2. 特異性驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)品

根據(jù)EP2.6.7,梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系,最適合用于特異性驗(yàn)證。因此下表列出的是這3個(gè)菌屬的產(chǎn)品。用戶(hù)也可選擇自己生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)遇到的細(xì)菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證。更多特異性驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)品請(qǐng)來(lái)電咨詢(xún)或訪問(wèn)締一公司網(wǎng)站頁(yè)面:http://www.dyshengwu.com/cn/list_19.aspx?lcid=313


序號(hào)

品名

貨號(hào)

規(guī)格




1

丙酮丁酸梭菌基因組DNA

英文名:Genomic DNA Extracts -Clostridium acetobutylicum

51-0792

≈10ng/管




2

產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA

英文名:Genomic DNA Extracts-Clostridium perfringens

2108-00756

≈10ng/管




3

嗜酸乳桿菌基因組DNA

英文名:Genomic DNA Extracts-Lactobacillus acidophilus

51-1723

≈10ng/管




4

牛鏈球菌基因組DNA

英文名:Genomic DNA Extracts-Streptococcus bovis

2122-20480

≈10ng/管




5

無(wú)乳鏈球菌基因組DNA

英文名:Genomic DNA Extracts-Streptococcus dysgalactiae

2123-06176

≈10ng/管




6

變異鏈球菌基因組DNA

英文名:Genomic DNA Extracts-Streptococcus mutans

2126-20523

≈10ng/管




7

肺炎鏈球菌基因組DNA

英文名:Genomic DNA Extracts-Streptococcus pneumoniae

51-0566

≈10ng/管



8

血鏈球菌基因組DNA

英文名:Genomic DNA Extracts-Streptococcus sanguinis

2139-20068

≈10ng/管



表3.
其他輔助產(chǎn)品


序號(hào)

品名

貨號(hào)

規(guī)格







1

內(nèi)控對(duì)照(適合qPCR)

英文名:Internal Control DNA extra

(說(shuō)明:Verno? Gem qEP試劑盒已提供有獨(dú)立包裝的內(nèi)控對(duì)照,用于監(jiān)測(cè)DNA提取和qPCR過(guò)程。如有更多需要,該對(duì)照也可單獨(dú)購(gòu)買(mǎi))

11-9905

4管/盒









2

蛋白酶K

英文名:Proteinase K

(說(shuō)明:如果樣本的蛋白含量>10mg/ml,會(huì)在支原體DNA抽提時(shí)堵塞離心柱,影響DNA抽提。建議先用德國(guó)MB公司的蛋白酶K消化,以保證支原體檢測(cè)的最高靈敏度。操作詳情請(qǐng)見(jiàn)德國(guó)MB公司的支原體DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū))

56-0002

50次/盒



表4. qPCR方法驗(yàn)證所需設(shè)備、儀器


序號(hào)

設(shè)備


1

qPCR儀


2

移液器和帶濾芯吸頭(10、100和1000 μl)


3

超凈臺(tái)


4

小型離心機(jī)(適合1.5ml管)


5

恒溫儀(適合1.5ml或2ml反應(yīng)管,用于DNA提取時(shí)洗脫液的預(yù)熱)


6

自動(dòng)核酸提取設(shè)備(可選)。也可手工提取。


希望以上信息能給您帶來(lái)幫助。

如您對(duì)以上產(chǎn)品感興趣,需要訂購(gòu)或進(jìn)一步咨詢(xún)?cè)斍?,?qǐng)聯(lián)系德國(guó)MB中國(guó)區(qū)總代理:北京締一生物科技有限公司。


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