怎樣給細(xì)胞做支原體篩查

細(xì)胞培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)操作和科研基礎(chǔ)。其中，保證細(xì)胞不受支原體的污染是決定實(shí)驗(yàn)成敗的重要環(huán)節(jié)。然而，支原體污染細(xì)胞的發(fā)生率又非常高,有報(bào)道高達(dá)63%。

那么，這些支原體污染是從哪里來(lái)的呢？

常可見(jiàn)以下來(lái)源：

特別是支原體的污染能通過(guò)細(xì)胞操作產(chǎn)生的氣溶膠或液滴傳播。一瓶被支原體污染的細(xì)胞足以威脅到其他培養(yǎng)的細(xì)胞。因此，定期對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行支原體的監(jiān)測(cè)是非常重要的。

在支原體的各種檢測(cè)方法中，常規(guī)PCR法以其

①靈敏度高，特異性好；

②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果；

③操作簡(jiǎn)單；

④無(wú)須昂貴儀器等特點(diǎn)廣受青睞。

但不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異較大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

這里小編向您推薦的是德國(guó)Minerva Biolabs公司的常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒（一步法）（英文名：Venor?Gem OneStep），它經(jīng)過(guò)許多用戶使用過(guò)，廣受好評(píng)。

產(chǎn)品介紹

其中貨號(hào)11-8025、11-8050為常備現(xiàn)貨。

優(yōu)勢(shì)

①高特異性。如存在支原體污染，則只在270bp左右有一條陽(yáng)性條帶，無(wú)雜帶現(xiàn)象，方便辨識(shí)。對(duì)其他物種如細(xì)菌、真核生物DNA無(wú)交叉反應(yīng)。

②可檢測(cè)的支原體種類豐富。支原體屬柔膜體綱、支原體目，下分為支原體科、無(wú)膽甾原體科和脲原體科，一共有100多種。Venor?Gem一步法試劑盒可檢測(cè)85種支原體科成員(含所有污染細(xì)胞的常見(jiàn)支原體)、7種無(wú)膽甾原體和1種脲原體，十分全面。

③所需樣本量少，僅需2ul。

④靈敏度高，靈敏度高，即使每個(gè)反應(yīng)只有20個(gè)基因組拷貝，也可以檢測(cè)出來(lái)。

⑤結(jié)果可靠。檢測(cè)時(shí)含陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和內(nèi)控對(duì)照，可避免假陰性和假陽(yáng)性。

⑥試劑穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單。試劑盒內(nèi)的PCR mix和陽(yáng)性對(duì)照均為凍干粉，穩(wěn)定性強(qiáng)。只需復(fù)溶后即可立即使用，除樣品外，無(wú)須添加其他試劑。PCR mix已包含內(nèi)控對(duì)照，無(wú)須再單獨(dú)添加（因此被稱為一步法）。

適用范圍

適用于支原體的篩查。適合細(xì)胞培養(yǎng)物和生物樣品，僅作研究使用，不適合藥廠的放行檢測(cè)。不適合臨床診斷。

操作步驟

第1步：樣本處理

第2步：試劑制備

第3步：PCR體系建立

第4步：?jiǎn)?dòng)PCR反應(yīng)

第5步：電泳結(jié)果分析

191bp為內(nèi)控對(duì)照條帶，表明PCR反應(yīng)正常。

當(dāng)樣本存在支原體污染時(shí)，由于內(nèi)控對(duì)照與支原體DNA存在競(jìng)爭(zhēng)，內(nèi)控對(duì)照條帶變?nèi)酰ɡ绠?dāng)支原體DNA＞103拷貝時(shí)）。

當(dāng)支原體DNA＞104拷貝時(shí)，內(nèi)控對(duì)照條帶會(huì)完全消失。

在80-90bp可能存在引物退火形成的二聚體條帶，此條帶不影響檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果詮釋可依據(jù)下表